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行業(yè)應(yīng)用

核酸引物的純化及HPLC檢測(cè)方法

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作者：依利特 來源：未知 2025-01-13

核酸引物是指人工合成的兩段寡核苷酸序列，一段與目的基因一端的一條DNA模板鏈互補(bǔ)，另一段與目的基因另一端的另一條DNA模板鏈互補(bǔ)。它是DNA復(fù)制開始時(shí)DNA聚合酶的結(jié)合位點(diǎn)，所以引物的純度關(guān)系到PCR擴(kuò)增的結(jié)果，尤其是對(duì)用于測(cè)序、克隆的引物。因此引物合成之后一般都需要做進(jìn)一步的純化。

核酸引物純化

核酸引物純化現(xiàn)在引物純化方式有很多種,目前常見的主要有C18柱脫鹽、RPC純化、ePAGE純化、PAGE純化以及HPLC純化等，各純化方式對(duì)比如下。

純化方式純化特點(diǎn)
C18柱脫鹽對(duì)DNA有特異性吸附，可被有機(jī)溶液洗脫，但不會(huì)被水洗脫，因此能有效地去除鹽分，但不能有效去除比目的片段短的小片段。該方法一般不會(huì)對(duì)普通PCR反應(yīng)產(chǎn)生影響。對(duì)于需要用于測(cè)序、克隆的引物不能使用這個(gè)級(jí)別。
RPC純化RPC純化是通過反相凈化濾芯 (Reverse Phase Cartridge) 對(duì)引物進(jìn)行純化，純化原理與反相HPLC純化一樣。但它是一種有效且更加經(jīng)濟(jì)的純化方式。該純化方法對(duì)引物長(zhǎng)度為15～40mer更為適用。RPC純化的引物可以應(yīng)用于DNA測(cè)序、 PCR及基因合成等。
ePAGE純化ePAGE是一種利用快速電泳對(duì)引物進(jìn)行分離純化的方法，具有通量大，速度快的特點(diǎn)。依靠全自動(dòng)進(jìn)樣，快速電泳，自動(dòng)純化等設(shè)備，短時(shí)間內(nèi)完成DNA條帶的分離純化。該純化方法對(duì)<15 mer和>60me的引物不適用。但純度可滿足大多分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)需求。
PAGE純化PAGE純化法是使用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，對(duì)引物DNA進(jìn)行分離，然后從凝膠中回收目的DNA。PAGE純化法也是一種非常有效的DNA純化方法，純化后的DNA純度大于90%，對(duì)長(zhǎng)鏈Oligo DNA (大于50mer)的純化特別有效。
HPLC純化HPLC純化是利用高效液相色譜的原理，對(duì)引物DNA進(jìn)行純化。該方法能達(dá)到很高的純度和靈敏度。該法的缺點(diǎn)是成本較高，批量生產(chǎn)效率不高。HPLC純化主要用于短鏈和修飾引物的純化。

在使用HPLC方法對(duì)引物DNA的分析和純化中，常用的有離子交換（ion-exchange）HPLC和反相HPLC。反相HPLC一般純度能大于90%；離子交換 HPLC純度能大于95%，并且可以有效的去除N-1短片段，對(duì)純化短鏈引物＜15mer特別有效。

依利特最近推出的核酸純化系統(tǒng)，是一套多功能制備系統(tǒng)，流量范圍可達(dá)100mL/min，同時(shí)具備雙波長(zhǎng)檢測(cè)功能，可實(shí)現(xiàn)進(jìn)樣和收集同時(shí)進(jìn)行，兼容多種規(guī)格托盤和試管。與之相匹配的SinoPak BEH T-C18 反相色譜柱以及Bioassist 陰離子交換柱，純化效率高，色譜柱壽命長(zhǎng)，是核酸純化的不二之選。

核酸引物純度檢測(cè)

純化完成后，引物純度檢測(cè)也是必備的一個(gè)步驟。HPLC是最常用的一種分析方法，參考國(guó)標(biāo)GB/T 34797-2017，核酸引物純度的分析色譜條件如下：

色譜柱：SinoPak BEH AQ-C18 色譜柱 3μm 4.6*50mm

流動(dòng)相：A：0.1mol/L TEAA；B：乙腈，梯度洗脫

0-15min 流動(dòng)相B從5%到30%

檢測(cè)波長(zhǎng)：260nm

流速：1.0mL/min

柱溫：60℃

SinoPak BEH AQ-C18色譜柱是依利特最新研發(fā)并推出的全新一代雜化硅膠色譜柱，通過特殊的三鍵鍵合工藝，極大降低鍵合相脫落。該色譜柱不但可以耐純水，在具備高的柱效和機(jī)械強(qiáng)度的同時(shí)，還具有很寬pH范圍穩(wěn)定性，即使在極端的條件下，也能保持很好的柱壽命。SinoPak BEH AQ-C18色譜柱有三種不同的孔徑[130?、200?和300?] ，適用于從小分子分析到大分子生物制藥分析的各類應(yīng)用。

分析純化系統(tǒng)配置如下

序號(hào)設(shè)備型號(hào)主要參數(shù)
1P3170高壓恒流泵流速范圍：0.01~100.00mL/min耐壓：30MPa
2UV3150雙波長(zhǎng)紫外-可見檢測(cè)器分析型：10mm半制備型：2mm制備型：0.5~2mm可調(diào)
3S3150PF自動(dòng)進(jìn)餾器進(jìn)樣范圍：10μL~20mL（最大可達(dá)25mL）強(qiáng)制、時(shí)間、閾值、斜率等多種收集模式
4TP3100溶劑托盤/
5Kromstation色譜數(shù)據(jù)工作站可對(duì)儀器進(jìn)行全反控
6Bioassist Q分析型陰離子交換柱10μm 4.6×50mm
Bioassist Q制備型陰離子交換柱13μm 10×100mm
SinoPak BEH AQ-C183μm 4.6×50mm （分析型）
SinoPak BEH AQ-C185μm 10×250mm （制備型）



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