簡介?

水溶性維生素 (WSV) 主要由復(fù)合維生素 B 組成，是許多食品，尤其嬰兒配方奶粉的基本成分。這些維生素在代謝途徑中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，日常飲食攝入可以產(chǎn)生顯著健康獲益。?

由于美國食品藥品監(jiān)督管理局 (FDA) 制定了這些維生素的每日營養(yǎng)推薦值，因此食品和補(bǔ)充劑生產(chǎn)商以及獨(dú)立檢測實(shí)驗(yàn)室需要能夠定量鑒定該類產(chǎn)品中的維生素含量。在進(jìn)行強(qiáng)化食品分析時，由于維生素濃度范圍較廣，與每日容許攝取量保持一致尤其具有挑戰(zhàn)性 (見表 1)。例如，在嬰兒牛奶中，維生素 B12 (氰鈷維生素) 的濃度為 1-2ppb，而維生素 B2 (核黃素) 的濃度則高達(dá) 1000 倍 (1-2 pm)。因此，任何定量分析方法都必須能夠適應(yīng)這種廣泛的濃度分布。

我們提出了一種 LC-MS/MS 方法，一次進(jìn)樣即可定量分析 B 族維生素。分析的維生素包括維生素 B1 (硫胺素)、B2 (核黃素)、B3 (煙酸)、B3*(煙酰胺)、B6 (吡哆醇)、B7 (生物素)、B9 (葉酸) 和維生素 B12 (氰鈷胺)，使用三個內(nèi)標(biāo)。采用簡單的液液萃取法從嬰兒配方奶粉中提取維生素。樣品提取與快速分析方法 (<6 分鐘) 相結(jié)合具有穩(wěn)定性 / 可靠性，并且耗時少。?

實(shí)驗(yàn)?

硬件 / 軟件?

液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜分離使用 EClassical3200L-MS2Vertical 9100 液相質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，所有儀器控制、分析和數(shù)據(jù)處理均使用液質(zhì)軟件平臺執(zhí)行。?

方法參數(shù)?

LC 和 MS/MS 方法參數(shù)分別見表 2 和表 3。

溶劑、標(biāo)準(zhǔn)品和樣品制備?

使用的所有溶劑、試劑和稀釋劑均為 HPLC 級，并通過 0.22-um 尼龍針頭式過濾器過濾。?

對于所有樣品的稀釋，使用 5-mM 甲酸銨，并用 10% 甲酸調(diào)整 pH 為 4.9。?

所有 B 族維生素標(biāo)準(zhǔn)品，包括 B1 (硫胺素)、B2 (核黃素)、B3 (煙酸)、B3*(煙酰胺)、B6 (吡哆醇)、B7 (生物素)、B9 (葉酸) 和 B12 (氰鈷胺) 均從 Sigma-Aldrich Inc.,Saint-Louis,MO. 購買。?

為了校準(zhǔn)和定量，使用了三個內(nèi)標(biāo)：維生素 B1"(硫胺素；?13C4?C8?H17? N4?OS+)、B7"(生物素；?C10?D2?H14? N2?O3? S) 和 B2'(核黃素；?13C4?C13?H2015? N2? N2?O6?))，全部來自 Sigma-Aldrich Inc.。校準(zhǔn) B3、B3*、B6 和 B1 時采用 B1'，校準(zhǔn) B7、B9 和 B12 時采用 B7，校準(zhǔn) B2 時采用 B2。?

分析樣品包括兩種商購獲得的嬰兒配方奶粉，標(biāo)記為 IF1 和 IF2。?

為了防止可能的標(biāo)準(zhǔn)品或樣品不穩(wěn)定性，所有儲備和工作標(biāo)準(zhǔn)品均冷藏存儲，直到使用；所有制備樣品均在 4 小時內(nèi)進(jìn)行分析，并且只使用琥珀色 2mL LC 小瓶。?

所有標(biāo)準(zhǔn)品和樣品均通過 0.22-um 尼龍過濾器過濾。?

實(shí)驗(yàn)?

標(biāo)準(zhǔn)品制備?

在 250mL 容量瓶中制備 40ug/mL 的 B2、B9 和 B7 儲備標(biāo)準(zhǔn)品。由于這三種維生素在堿性條件下溶解佳，所以首先在燒瓶中加入 50mL0.05% 氫氧化銨?(NH4?OH)，搖晃直到標(biāo)準(zhǔn)品完全溶解。然后加入稀釋劑，定容至刻度。?

直接使用稀釋劑制備 40ug/mL 的 B3、B3*、B6 和 B1 儲備標(biāo)準(zhǔn)品和 5pg/mL 的 B12 儲備標(biāo)準(zhǔn)品。?

對于工作標(biāo)準(zhǔn)品，向 100mL 容量瓶中加入三種儲備液各 25mL 以及 25mL 稀釋劑。搖晃后，將燒瓶冷藏。本工作標(biāo)準(zhǔn)品也作為校正濃度級別 6 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，除 B12 (1.50ug/mL) 外，各維生素含量均為 10pg/mL。?

加入各同位素的維生素標(biāo)準(zhǔn)純品，制備內(nèi)標(biāo)儲備液 (ISTD)，如下：將 2mg 的 B1、5mg 的 B7 和 1mg 的 B2 分別轉(zhuǎn)移到 20mL、250mL 和 10mL 容量瓶中。為了輔助溶解，首先將 B1 和 B2' 標(biāo)準(zhǔn)品轉(zhuǎn)移到每個容量瓶，用 1mL 0.05%?NH4?OH分 5 次潤洗。然后用稀釋劑分別將三個容量瓶定容至標(biāo)線。獲得的 B1 和 B2 儲備濃度為 10ug/mL，B7 為 20pg/mL。?

通過對工作標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行連續(xù)稀釋，制備 6 個校準(zhǔn)濃度級別。獲得的維生素濃度見表 4。由于維生素 B12 的 DV 指南值明顯較低 (0.006mg)，因此使用較低的濃度范圍對其進(jìn)行校準(zhǔn)。每批樣品運(yùn)行前，分別移取各校準(zhǔn)濃度級別標(biāo)準(zhǔn)溶液 50mL 至 50mL 容量瓶中，加入 50μL ISTD B1、B2 和 250μL ISTD B7，使內(nèi)標(biāo)濃度為 0.1ug/mL。注：如果可用的任何校準(zhǔn)濃度級別標(biāo)準(zhǔn)溶液低于 50mL，ISTD 應(yīng)相對可用量成比例添加。所有校準(zhǔn)物均一式三份進(jìn)樣。?

樣品制備?

在皮重 50mL 離心管中稱取所需量，然后加入 20mL 稀釋劑，制備兩種嬰兒配方奶粉 (標(biāo)記為 IF1 和 IF2)。所需量根據(jù)每種產(chǎn)品標(biāo)示量中奶粉與水的建議比例確定。每個離心管脈沖渦旋 15 分鐘，加入 ISTD B1 和 B2'40μL 以及 ISTD B7'200μL，使內(nèi)標(biāo)濃度為 0.2ug/ml，樣品中內(nèi)標(biāo)加標(biāo)至 0.2ug/mL，在接下來樣品制備過程中，內(nèi)標(biāo)濃度將被稀釋 2 倍。?

取 20mL 乙腈，用 10μL 的 10% 甲酸酸化，然后加入每個試管。隨后脈沖渦旋 5 分鐘，以 7800rpm 離心分離 10 分鐘。加入酸化的 ACN 引起蛋白質(zhì)沉淀 / 淀析，從而可以通過離心除去脂肪 / 固體物質(zhì)。然后從三個試管中分別小心地轉(zhuǎn)移 10.0mL 上清液到 50mL 離心管中，并干燥至約 mL。然后，每管中裝入稀釋劑至 10mL 刻度，脈沖渦旋 3 分鐘，并以 7800rpm 離心 5 分鐘。各取 1mL 上清液過濾到 2mL 小瓶中。所有樣品一式三份進(jìn)樣。?

結(jié)果和討論?

使用規(guī)定的方法參數(shù)，圖 1 顯示了重復(fù)進(jìn)樣 12 次濃度級別 5 的標(biāo)準(zhǔn)溶液各 MRM 通道的譜圖疊加。所有 8 種維生素均有良好分離度，在不到 4 分鐘內(nèi)洗脫，重復(fù)進(jìn)樣 12 針的譜圖疊加，展現(xiàn)出了的色譜重現(xiàn)性。?

圖 2 顯示了維生素 B1 和 B12 的校準(zhǔn)曲線，表現(xiàn)出的線性 (?R2≥0.999；?n=3)。維生素 B2、B3*、B7 和 B12 采用 6 級校準(zhǔn)。對于維生素 B1、B3、B6 和 B9，使用 5 級校準(zhǔn)。所有 8 種維生素的?R2>0.996。

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